EHA101感受態(tài)細(xì)胞

簡(jiǎn)要描述：EHA101感受態(tài)細(xì)胞
EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 （pTiBo542DT-DNA），適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

更新時(shí)間：2022-01-21

廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家

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詳情介紹

品牌	其他品牌	貨號(hào)	BFNC86103
規(guī)格	10x100ul/50x100ul/100x100ul	供貨周期	現(xiàn)貨
主要用途	僅用于科研	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)

EHA101感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86103-01(10×100ul)/BFNC86103-02(50×100ul) /BFNC86103-03(100×100ul)

EHA101： 100μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期)： -80℃（12個(gè)月）

基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline

產(chǎn)品說(shuō)明

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：kan，賦予EHA101菌株和卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。

青旗生物生產(chǎn)的EHA101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pK7WGF2質(zhì)粒（壯觀霉素抗性）檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，*使用前盡量做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手bo打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。

（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng)48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí)）。

EHA101感受態(tài)細(xì)胞

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0
			Agar	－	15 g

注意事項(xiàng)

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司EHA101感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml 壯觀霉素，若所用平板同時(shí)含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。