Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86074-01(10×100ul)/BFNC86074-02(50×100ul)

Rosetta-gami(DE3)pLysS：                        100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                             -80℃（6個(gè)月）

基因型

Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL(DE3) F′[lac⁺ lacI^q pro] gor522::Tn10 trxB::kan pLysSRARE2 (Cam^R, Str^R, Tet^R)

產(chǎn)品說(shuō)明

Rosetta-gami(DE3)pLysS 菌株聚合了不同原核表達(dá)菌株的優(yōu)勢(shì)：

＊ Rosetta-gami賦予其 Rosetta和Origami的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平，并且包含突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。

＊ 該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)適合T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。

＊ 該菌株攜帶的pLysS質(zhì)粒含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。Rosetta-gami(DE3)pLysS 菌株具有卡那霉素，氯霉素，鏈霉素，四環(huán)素抗性，為亮氨酸生長(zhǎng)缺陷型菌株。

青旗生物生產(chǎn)的Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

Rosetta-gami(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素

Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 µg/ml.

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞盡量在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

4. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。

5. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

6. Rosetta-gami(DE3)pLysS 菌株攜帶 pLysS質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34 µg/ml氯霉素，以防質(zhì)粒丟失。

7. 具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。