ATCC細(xì)胞庫的原理在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
 

　　細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

 

　　ATCC細(xì)胞庫培養(yǎng)方法：

　　1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代

　　①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或鹽水清洗1-2次；

　?、诩尤?ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

　?、?-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

　　④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

　?、萦眯迈r培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

　　⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

 

　　2、細(xì)胞復(fù)蘇：

　　①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

　?、谠?000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

 

　　3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種

　?、贄壢ヅ囵B(yǎng)上清，用PBS或鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶；

　?、?-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

　　③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

　?、軐龃婀芊湃氤绦蚪禍睾?，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。