操作步驟

1.標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL；。

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.加酶：每孔加入酶標試劑 100μl，空白孔除外。

4.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。

5.配液：將 20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。

6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。

7.顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

8.終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

9.測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。

 

樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收 集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上 進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。